Kitul TIANScriptⅡ RT

ARN-ul A-1 este degradat

—— Purificați ARN de înaltă calitate, fără contaminare. Materialul din care este extras ARN trebuie să fie cât mai proaspăt posibil pentru a preveni degradarea ARN-ului. Analizați integritatea ARN pe gelul denaturat înainte de reacția RT. După extracția ARN-ului, acesta trebuie păstrat în formamidă 100%. Dacă se utilizează inhibitor de RNază, temperatura de încălzire trebuie să fie <45 ° C, iar pH-ul să fie mai mic de 8,0, altfel inhibitorul va elibera toate RNazele legate. Mai mult, inhibitorul RNazei trebuie adăugat în soluții care conțin DTT ≥ 0,8 mM.

ARN-ul A-2 conține inhibitori ai reacțiilor de transcripție inversă

—— Inhibitorii de transcripție inversă includ SDS, EDTA, glicerol, pirofosfat de sodiu, spermidină, formamidă, sare de guanidină, etc. Se spală precipitațiile ARN cu 70% (v / v) etanol pentru a elimina inhibitorii.

A-3 Recuocare insuficientă a primerilor utilizați pentru sintetizarea primei catene de ADNc

—— Determinați că temperatura de recoacere este potrivită pentru primerii utilizați în experiment. Pentru hexameri aleatori, se recomandă menținerea temperaturii la 25 ° C timp de 10 minute înainte de atingerea temperaturii de reacție. Pentru primeri specifici genei (GSP), încercați alte GSP sau comutați la oligo (dT) sau hexamer aleatoriu.

A-4 Cantitate mică de ARN de pornire

——Măriți cantitatea de ARN. Pentru probele de ARN mai mici de 50 ng, de la 0,1 μg la 0,5 μg acetil BSA poate fi utilizat în sinteza ADNc de catenă

A-5 Secvența țintă nu este exprimată în țesuturile analizate.

—— Încercați alte țesuturi.

Reacția PCR A-6 eșuează

——Pentru RT-PCR în două etape, șablonul ADNc din etapa PCR nu poate depăși 1/5 din volumul de reacție.

A-1 Recuocere nespecifică de grunduri și șabloane

—— Capătul 3 ’al primerilor nu trebuie să conțină 2-3 dG sau dC. Utilizați primeri genici specifici în prima sinteză a firelor în loc de primeri aleatori sau oligo (dT). Utilizați o temperatură mai mare de recoacere în primele câteva cicluri, apoi o temperatură mai mică de recoacere. Utilizați ADN polimeraza Taq cu pornire la cald pentru PCR pentru a îmbunătăți specificitatea reacției.

A-2 Proiectare slabă a primerilor specifici genei

—— Urmați aceleași principii pentru proiectarea grundului de amplificare.

ARN A-3 contaminat cu ADN genomic

——Tractați ARN cu DNază de gradul PCR I. Configurați o reacție de control fără transcripție inversă pentru a detecta contaminarea ADN-ului.

A-4 Formarea dimerului de grund

——Design primeri fără secvențe complementare la capătul 3 '.

A-5 Prea mare Mg²⁺ concentraţie

——Optimizați Mg²⁺ concentrație pentru fiecare combinație de șablon și grund

A-6 Contaminat cu ADN străin

—— Utilizați vârfuri rezistente la aerosoli și enzime UDG.

A-1 Conținutul primului produs cu fir este prea mare

—— Reduceți cantitatea de primul produs de catenă în etapa de reacție convențională PCR.

A-2 Cantitate prea mare de primer în reacția PCR

—— Reduceți introducerea primerului.

A-3 Prea multe cicluri

—— Optimizați condițiile de reacție PCR și reduceți numărul ciclului PCR.

A-4 Temperatură de recoacere prea scăzută

——Măriți temperatura de recoacere pentru a preveni inițierea și extinderea nespecifice.

A-5 Amplificarea nespecifică a fragmentelor oligonucleotidice generate de degradarea ADN-ului ADN — Extrageți ARN de înaltă calitate pentru a preveni contaminarea ADN-ului.

RT-PCR este de a inversa transcrierea ARN în ADNc și apoi de a utiliza ADNc transcris invers ca model pentru reacția PCR pentru a amplifica fragmentul țintă. Alegeți fie primeri aleatori, Oligo dT și primeri specifici genei în funcție de condițiile specifice ale experimentului. Toți primerii de mai sus pot fi folosiți pentru ARNm cu celule eucariote scurte fără structură de ac de păr.

Grund aleatoriu: Potrivit pentru ARN-ul lung cu structură cu ac de păr, precum și pentru toate tipurile de ARN, cum ar fi ARNr, ARNm, ARNt, etc. Acestea sunt utilizate în principal pentru reacția RT-PCR a unui singur șablon.

Oligo dT: Potrivit pentru ARN cu coadă PolyA (ARN procariot, ARNc eucariot Oligo dT și ARNt nu au cozi PolyA). Deoarece Oligo dT este legat de coada PolyA, calitatea probelor de ARN trebuie să fie ridicată și chiar și o cantitate mică de degradare va reduce foarte mult cantitatea de sinteză ADNc de lungime completă.

Grund specific pentru gen: complementar secvenței șablon, adecvat pentru situații în care secvența țintă este cunoscută.

Există două moduri:

1. Metoda de referință internă: În teorie, ADNc este fragmente de ADN de diferite lungimi, astfel încât rezultatul electroforezei este frotiul. Dacă abundența de ARN este mică, niciun produs nu va apărea în electroforeză, dar acest lucru nu înseamnă că niciun produs nu va fi amplificat prin PCR. În general, referința internă poate fi utilizată pentru a detecta ADNc. Dacă referința internă are rezultate, calitatea ADNc poate fi practic garantată (în câteva cazuri, dacă fragmentul genei țintă este prea lung, pot exista excepții).

2. Dacă există o genă cunoscută amplificată de acest șablon, aceasta poate fi verificată de primerii acestei gene. Amplificarea referinței interne nu înseamnă neapărat că nu există nicio problemă cu ADNc. Deoarece referința internă are abundență mare în ADNc, este ușor de amplificat. Dacă ADNc este parțial degradat din diverse motive, din perspectiva probabilității, rezultatele PCR ale genelor țintă cu abundență redusă vor fi foarte afectate. În timp ce referința internă este încă abundentă, amplificarea probabil că nu va fi afectată.

Degradează parțial ARN-ul. Detectați integritatea și purificarea ARN-ului

Conținutul de ARN al diferitelor specii poate fi diferit, dar, în general, ARN-ul total extras trebuie să conțină două benzi clare 28S și 18S în electroforeză pe gel, iar luminozitatea primei benzi ar trebui să fie de două ori mai mare decât cea a celei din urmă. Banda 5S indică faptul că ARN-ul a fost degradat, iar luminozitatea sa este proporțională cu gradul de degradare. Amplificarea cu succes a referinței interne nu înseamnă că nu există nicio problemă cu ARN, deoarece referința internă este în abundență mare, ARN-ul poate fi amplificat atâta timp cât degradarea nu este severă. OD₂₆₀/ OD₂₈₀raportul ARN pur măsurat prin spectrofotometru trebuie să fie între 1,9 și 2,1. O cantitate mică de impurități proteice în ARN va reduce raportul. Atâta timp cât valoarea nu este prea mică, RT nu va fi afectat. Ceea ce contează cel mai mult pentru RT este integritatea ARN-ului.

Extinderea genei de referință interne poate indica doar că RT a reușit, dar nu este neapărat legată de calitatea catenei ADNc. Deoarece fragmentele de referință interne sunt în general de dimensiuni mici și de expresie ridicată, sunt mai ușor de reușit în transcrierea inversă. Cu toate acestea, dimensiunea și expresia genei țintă variază de la o genă la alta. Calitatea ADNc nu poate fi evaluată numai prin referință internă, în special pentru fragmentele țintă mai lungi de 2 kb.

Unele eșantioane au structuri secundare complexe sau au un conținut bogat de GC sau sunt prețioase cu o abundență redusă. În aceste cazuri, ar trebui selectată transcriptaza inversă adecvată în funcție de mărimea fragmentului țintă și a eșantionului. Pentru șabloanele de ARN cu conținut ridicat de GC și structură secundară complexă, este dificil să se deschidă structura secundară la temperatură scăzută sau cu transcriptază inversă comună. Pentru aceste șabloane, Quant Reverse Transcriptase poate fi selectat, deoarece performanța sa de transcriere inversă este evident mai bună decât cea a seriei M-MLV de transcriptază inversă, care poate transcrie invers diferite șabloane de ARN în mod eficient și transcrie ARN în ADN ADN în cea mai mare măsură. Atunci când se utilizează un set general de transcriptază inversă, un sistem de 20 μl poate transcrie în mod eficient doar 1 μg de ARN total. Vă rugăm să acordați atenție capacității maxime RT a kitului. Dacă șablonul este adăugat în exces, transcrierea inversă va favoriza ARN-ul cu abundență mare. Prin urmare, este mai bine să nu depășiți capacitatea maximă a sistemului.

A-1 Determinați dacă ARN-ul este degradat sever și dacă RT are succes

În general, motivul eșecului amplificării interne de referință este adesea cauzat de degradarea gravă a ARN-ului. Un alt motiv posibil este eșecul de transcriere inversă. Referința internă nu poate fi utilizată ca standard pentru a judeca calitatea catenei unice ADNc, dar poate fi utilizată ca standard pentru a judeca dacă transcrierea inversă are succes dacă nu există nicio problemă a calității ARN. Cel mai important lucru în procesul de transcriere inversă este menținerea unei temperaturi constante și a unui sistem de reacție constant pentru a îmbunătăți eficiența reacției.

A-2 Determinați dacă primerii pentru amplificarea genelor interne de referință sunt fiabile și dacă există probleme cu reactivii utilizați în PCR.

Pentru cuantificarea relativă, ARN trebuie cuantificat înainte de transcrierea inversă, ceea ce este necesar și în multe kituri de transcriere inversă, de exemplu, cuantificați intrarea ARN ca 1 μg. Deoarece ADNc transcris invers este o soluție mixtă, incluzând ARN, oligo dT, enzimă, dNTP și chiar puțin reziduu de ADN, se va produce abaterea, deci este imposibil să se cuantifice cu precizie ADNc. Prin urmare, este necesară cuantificarea ARN. Având în vedere că eficiența transcripției inverse este aceeași la diferite eșantioane, cantitatea de ADNc obținută ar trebui să fie aceeași, iar analiza cantitativă poate arăta compararea nivelurilor de expresie ale diferitelor gene în aceeași cantitate de ARN total. Atunci când se efectuează PCR cantitativă cu fluorescență relativă, este posibil ca ADNc cantitativ să nu fie necesar după transcrierea inversă, deoarece gena internă de referință poate fi acționată ca referință.

Este în principal legat de gene, iar transcrierea inversă a fragmentului lung nu este fezabilă pentru majoritatea genelor. În primul rând, eficiența transcrierii inversate este mult mai mică decât cea a PCR. În al doilea rând, regiunea bogată în GC și structura secundară a multor gene restricționează atât transcripția inversă, cât și PCR. În cele din urmă, fidelitatea și eficiența amplificării PCR sunt dificil de garantat în același timp. În procesul de transcriere inversă, nimeni nu poate garanta obținerea unui fragment lung pentru gene cu copie redusă, în special folosind oligo dT. În ceea ce privește UTR de 5 'cu mai multe GC, este și mai dificil. Prin urmare, este încă o metodă rezonabilă de a inversa transcrierea cu primeri aleatori, de a găsi site-urile de scindare naturale din fragmentul țintă, de a amplifica pe segmente și apoi de a efectua digestia și ligarea de restricție. În general, este dificil să se amplifice direct fragmente mai mari de 2 kb, dar nu este întotdeauna imposibil să se obțină: 1. În primul rând, se garantează integritatea ARN / ARNm și se preferă extracția TRIZOL. 2. Setul M-MLV RT-PCR poate fi utilizat direct. Extindeți timpul de recoacere și măriți numărul ciclului în procesul de amplificare în mod corespunzător. Alternativ, PCR imbricată poate fi aplicată sau poate efectua mai întâi una sau două reacții cu o denaturare și un timp de extindere corespunzător prelungite înainte de amplificarea PCR normală, care poate ajuta la extinderea fragmentelor. Acordați atenție fidelității polimerazei. 3. Long Taq poate fi utilizat în PCR pentru a obține rezultate ideale. 4. Pentru aplicarea expresiei proteinelor, ar trebui aplicată polimeraza de înaltă fidelitate.

Există două tipuri de transcriptază inversă oferite de TIANGEN: Quant / King RTase și TIANScript M-MLV. Principala diferență dintre ele este cantitatea de intrare de șabloane. Quant este o transcriptază inversă unică, care este diferită de M-MLV utilizat în mod obișnuit, derivat din virusul leucemiei murinice Moloney. Quant este o nouă transcriptază inversă de înaltă eficiență exprimată recombinant prin Ingineria Escherichia coli. Quant este potrivit pentru amplificarea a 50 ng-2 μg de ARN cu activitate transcripțională inversă ridicată și randament ridicat. În comparație cu MMLV obișnuit sau AMV, cea mai mare caracteristică a lui Quant este că are o afinitate foarte puternică cu șabloanele de ARN și poate inversa șabloanele complexe de transcriere fără denaturare la temperatură ridicată. Pentru șabloanele cu conținut GC mai ridicat, eficiența inversă este mai mare. Cu toate acestea, această transcriptază inversă are activitate RNază H, care poate afecta lungimea produsului ADNc (potrivit pentru șabloane <4,5 kb). Pentru transcrierea inversă convențională, se recomandă transcriptaza inversă TIANScript MMLV. Această RTază este o enzimă modificată cu activitate RNază H foarte slabă, care este potrivită pentru sinteza lungă (> 5 kb) de ADNc.

Transcrierea inversă într-un singur pas și amplificarea PCR sunt finalizate în același tub fără a deschide capacul tubului între sinteza ADNc și amplificare, ceea ce este util pentru a reduce contaminarea. Deoarece toate probele de ADNc obținute sunt utilizate pentru amplificare, sensibilitatea este mai mare, cu un minim de 0,01 pg de ARN total. Pentru RTPCR într-o etapă de succes, primerii specifici genei sunt utilizați în general pentru a iniția sinteza ADNc. Metoda în doi pași, și anume transcrierea inversă și amplificarea PCR se realizează în două etape. În primul rând, transcrierea inversă se efectuează dintr-un șablon de ARN pentru a obține ADNc, iar ADNc obținut este supus uneia sau mai multor reacții PCR diferite. Metoda în doi pași poate utiliza oligo (dT) sau primeri aleatori pentru a ghida sinteza primei catenă de ADNc și poate transcrie invers toate informațiile ARNm dintr-o probă specifică.