2 × Pfu PCR Mix

Șablon A-1

■ Șablonul conține impurități proteice sau inhibitori Taq etc. —— Purificați șablonul ADN, eliminați impuritățile proteice sau extrageți ADN șablon cu kituri de purificare.

■ Denaturarea șablonului nu este completă - Creșteți corespunzător temperatura de denaturare și prelungiți timpul de denaturare.

■ Degradarea șablonului - Pregătiți din nou șablonul.

A-2 Grund

■ Calitatea slabă a primerilor —— Re-sintetizați primerul.

■ Degradarea primerului ——Aliquot primerii cu concentrație mare în volum mic pentru conservare. Evitați înghețarea și dezghețarea multiplă sau crioconservarea pe termen lung de 4 ° C.

■ Proiectarea necorespunzătoare a grundurilor (de exemplu, lungimea grundului nu este suficientă, dimerul format între grunduri etc.) -Grunduri de reproiectare (evita formarea dimerului grundului și a structurii secundare)

A-3 Mg²⁺concentraţie

■ Mg²⁺ concentrația este prea mică ——Măriți în mod corespunzător Mg²⁺ concentrație: Optimizați Mg²⁺ concentrație printr-o serie de reacții de la 1 mM la 3 mM cu un interval de 0,5 mM pentru a determina Mg optim²⁺ concentrația pentru fiecare șablon și grund.

A-4 Temperatura de recoacere

■ Temperatura ridicată de recoacere afectează legarea grundului și șablonului. —— Reduceți temperatura de recoacere și optimizați starea cu un gradient de 2 ° C.

A-5 Timp de prelungire

■ Timp scurt de prelungire —— Măriți timpul de prelungire.

Fenomene: eșantioanele negative arată, de asemenea, benzile secvenței țintă.

A-1 Contaminarea PCR

■ Contaminarea încrucișată a secvenței țintă sau a produselor de amplificare —— Nu pipetați cu atenție proba care conține secvența țintă în eșantionul negativ sau vărsați-le din tubul centrifugii. Reactivii sau echipamentele ar trebui să fie autoclavizate pentru a elimina acizii nucleici existenți, iar existența contaminării ar trebui determinată prin experimente de control negativ.

■ Contaminarea reactivului ——Alocați reactivii și depozitați la temperatură scăzută.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ concentrația este prea mică ——Măriți în mod corespunzător Mg²⁺ concentrație: Optimizați Mg²⁺ concentrație printr-o serie de reacții de la 1 mM la 3 mM cu un interval de 0,5 mM pentru a determina Mg optim²⁺ concentrația pentru fiecare șablon și grund.

■ Proiectarea necorespunzătoare a primerului, iar secvența țintă are omologie cu secvența non-țintă. —— Grunduri de reproiectare.

Fenomene: benzile de amplificare PCR sunt incompatibile cu dimensiunea așteptată, fie mare, fie mică, sau uneori apar ambele benzi de amplificare specifice și benzi de amplificare nespecifice.

A-1 Primer

■ Specificitate slabă a primerului

—— Grund pentru reproiectare.

■ Concentrația grundului este prea mare ——Măriți în mod corespunzător temperatura de denaturare și prelungiți timpul de denaturare.

A-2 Mg²⁺ concentraţie

■ Mg²⁺ concentrația este prea mare —— Reduceți în mod corespunzător concentrația de Mg2 +: Optimizați Mg²⁺ concentrație printr-o serie de reacții de la 1 mM la 3 mM cu un interval de 0,5 mM pentru a determina Mg optim²⁺ concentrația pentru fiecare șablon și grund.

A-3 Polimerază termostabilă

■ Cantitate excesivă de enzime —— Reduceți cantitatea enzimatică în mod adecvat la intervale de 0,5 U.

A-4 Temperatura de recoacere

■ Temperatura de recoacere este prea scăzută ——Măriți corespunzător temperatura de recoacere sau adoptați metoda de recoacere în două etape

A-5 cicluri PCR

■ Prea multe cicluri PCR —— Reduceți numărul de cicluri PCR.

A-1 Primer—— Specificitate slabă —— Re-proiectați grundul, schimbați poziția și lungimea grundului pentru a spori specificitatea acestuia; sau efectuați PCR imbricat.

A-2 Șablon ADN

—— Șablonul nu este pur —— Purificați șablonul sau extrageți ADN cu kituri de purificare.

A-3 Mg²⁺ concentraţie

——Mg²⁺ concentrația este prea mare —— Reduceți în mod corespunzător Mg²⁺ concentrație: Optimizați Mg²⁺ concentrație printr-o serie de reacții de la 1 mM la 3 mM cu un interval de 0,5 mM pentru a determina Mg optim²⁺ concentrația pentru fiecare șablon și grund.

A-4 dNTP

——Concentrația de dNTP este prea mare —— Reduceți în mod corespunzător concentrația de dNTP

A-5 Temperatura de recoacere

——Temperatura prea scăzută de recoacere ——Măriți corespunzător temperatura de recoacere

A-6 Cicluri

——Prea multe cicluri ——Optimizați numărul ciclului

Primul pas este alegerea polimerazei adecvate. Polimeraza Taq regulată nu poate fi corectată din cauza lipsei activității de exonuclează 3'-5 'și nepotrivirea va reduce considerabil eficiența extensiei fragmentelor. Prin urmare, polimeraza Taq obișnuită nu poate amplifica în mod eficient fragmente țintă mai mari de 5 kb. Taq polimeraza cu modificări speciale sau altă polimerază de înaltă fidelitate ar trebui selectată pentru a îmbunătăți eficiența extensiei și pentru a satisface nevoile de amplificare a fragmentelor lungi. În plus, amplificarea fragmentelor lungi necesită, de asemenea, ajustarea corespunzătoare a designului primerului, timpul de denaturare, timpul de extindere, pH-ul tampon etc. De obicei, primerii cu 18-24 bp pot duce la un randament mai bun. Pentru a preveni deteriorarea șablonului, timpul de denaturare la 94 ° C ar trebui redus la 30 sec sau mai puțin pe ciclu, iar timpul de creștere a temperaturii la 94 ° C înainte de amplificare ar trebui să fie mai mic de 1 min. Mai mult, setarea temperaturii de extindere la aproximativ 68 ° C și proiectarea timpului de extindere în funcție de rata de 1 kb / min poate asigura o amplificare eficientă a fragmentelor lungi.

Rata de eroare a amplificării PCR poate fi redusă utilizând diverse ADN polimeraze cu fidelitate ridicată. Dintre toate ADN polimerazele Taq găsite până acum, enzima Pfu are cea mai mică rată de eroare și cea mai mare fidelitate (vezi tabelul atașat). În plus față de selecția enzimei, cercetătorii pot reduce în continuare rata de mutație a PCR prin optimizarea condițiilor de reacție, inclusiv optimizarea compoziției tampon, concentrația polimerazei termostabile și optimizarea numărului ciclului PCR.